【经验】碱性磷酸酶的活性检测试剂盒

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摘要
碱性磷酸酶的活性检测试剂盒。常用于检测培养的成骨细胞、实验动物血清和骨组织中的碱性磷酸酶活性。
碱性磷酸酶(ALP)广泛分布于肝脏、骨、小肠之中。特别在骨代谢研究领域方面被用作为骨形成指标之一。本品是用p–硝基苯磷酸作为底物的碱性磷酸酶检测试剂盒，利用微孔板，可进行多种样品的检测。

【检测原理】
样品在含有p-硝基苯磷酸的碳酸盐缓冲液(pH9.8)中反应，在样品中的碱性磷酸酶作用下，p-硝基苯磷酸分解为p-硝基酚和磷酸。生成的p-硝基酚为碱性，呈黄色。根据测量其405nm的吸光值，计算出样品中碱性磷酸酶的活性。

■LabAssay TM ALP [p-硝基苯磷酸基质法]
【性能】
检测范围：>0.06 mmol/L
标准曲线范围：0～0.5 mmol/L
再现性：C.V.<10%

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2009-06-23 13:56 浏览 : 6022 回复 : 2

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楼主

cxbiosh

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2楼

【试剂的配制】
1）底物缓冲液：1片底物溶解于5mL底物溶解液中。
2）反应终止液：直接使用。
3）系列稀释标准液：将标准液用蒸馏水依次稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625 mmol/L等2倍率稀释液系列。

【标准操作法】
向96孔微孔板内添加100μl底物缓冲液和20μl样品，在微孔板震荡器上充分振荡1分钟后，37℃孵育15分钟。
　添加80μl反应终止液，在微孔板震荡器上充分振荡1分钟后，用酶标仪测量405nm处的吸光值
。同样方法进行空白(蒸馏水)对照和标准品的检测。

【活性单位的定义】
　在pH9.8，37℃情况下，1分钟内生成1nmol p-硝基酚所需的酶的活性为1个活力单位（U）。
活性（U/μl）= C/15 ×a　
　C：由标准曲线得到的OD值(A实验值减去A空白值)，计算p-硝基酚浓度(mmol/L=nmol/μl) 15：反应时间(min.)
　a：样品的稀释倍数
当样品为成骨细胞时，本试剂盒使用前需要预处理
?在48孔板上进行细胞培养后，除去培养基，用PBS冲洗感光板，各孔添加150μl 0.05%的曲拉通X，进行冻结→融化→冻结→融化操作。4℃，15,000rpm离心15分钟处理，将上清液移到新的辅助管，以此作为样品。

(注1）48孔板：培养时，一般不采用96孔板，多使用48孔板。

(注2) 曲拉通X的作用：溶解细胞膜，回收蛋白(细胞内含有ALP蛋白)的试剂。

(注3) 反复的冻结融化：原理不明，但这样做似乎可以提高ALP活性。

(注4) 也有不使用曲拉通X，用超声波降解法(超声波处理)对细胞造成物理性休克得到溶解产物的方法。

(注5) 曲拉通X的添加量：以150μL为例，孔中细胞约为20,000cell。

2009-06-23 14:32